Новые аспекты антиоксидантной терапии острого панкреатита (экспериментальные данные)

Анисимова А.А., Демин Д.Б.

Кафедра факультетской хирургии ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России

В статье показана эффективность применения тиоктовой кислоты в дозе 10 мг/кг в условиях экспериментального острого панкреатита у морских свинок. Установлено, что при применении тиоктовой кислоты значительно снижаются проявления ишемии и выраженность свободно-радикальных процессов, а также наблюдается стимуляция репаративных процессов в тканях печени и поджелудочной железы, что свидетельствовало об эффективности данного препарата в лечении экспериментального острого панкреатита.

Ключевые слова: Острый панкреатит, тиоктовая кислота, липопероксидация, ишемия.

 

Актуальность

      Проблема острого панкреатита (ОП), как ведущей патологии в структуре заболеваний поджелудочной железы (ПЖ), является одной из актуальных в современной экстренной абдоминальной хирургии [6; 8; 10, 14]. Данная патология традиционно считается одной из сложных в хирургии, что в первую очередь определяется летальностью 7-15%, достигающей  40-70% -  при деструктивных формах [1; 2; 4; 5; 13].

      Актуальность данной темы обусловлена тем, что несмотря на наличие большого числа исследований, внедрение современных методов диагностики и лечения, в том числе малоинвазивных хирургических технологий, заболеваемость и летальность при ОП остается высокой [3; 9].

       В многочисленных современных экспериментальных и клинических исследованиях показано, что определяющим моментом в развитии морфологических и биохимических изменений в ПЖ при ОП является несоответствие между избыточной активацией процессов свободнорадикального окисления и недостаточной реакцией со стороны системы антиоксидантной защиты организма, что можно трактовать как явление «оксидантного» стресса. В связи с этим лечебные мероприятия при ОП должны быть направлены на «обрыв» ведущих патогенетических звеньев, приводящих к панкреонекрозу [11].

      Так как ПЖ имеет низкую антиоксидантную защиту, а при ОП происходит еще большее ее угнетение, возникает патогенетически обусловленная необходимость применения при данном заболевании антиоксидантных препаратов [3; 7]. Ключевым моментом в комплексном лечении пациентов с деструкцией ПЖ является не только максимальное сохранение функционально активных участков железы, но и стимуляция в ней репаративных процессов без избыточного замещения пораженных участков соединительно-тканными структурами.

      К препаратам, обладающим мощными антиоксидантными свойствами, относится тиоктовая кислота (ТК). Комплексные морфофункциональные исследования по обоснованию применения ТК при экспериментальном остром панкреатите (ЭОП) отсутствуют. Особенно это касается установления и уточнения тех закономерностей, которые лежат в основе патогенеза данного заболевания.

      Целью исследования явилось обоснование эффективности применения ТК в лечении ОП на основании морфофункциональных данных в эксперименте.

      Материалы и методы. Исследования по изучению морфологических и биохимических изменений в ПЖ и печени в условиях ЭОП при лечении ТК были проведены на 90 половозрелых морских свинках самцах с массой 550-720 г в 3 сериях опытов. Морские свинки были разделены на три серии по 30 особей в каждой. В 1 серию входили морские свинки с ЭОП, которые не получали лечения. Во 2 серии экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно через катетер 0,9% раствор хлорида натрия в разовой дозе 6 мл/кг через 2 часа от начала опыта и затем ежедневно. В 3серии в качестве лечения морские свинки с ЭОП получали ТК в дозе 10 мг/кг через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно. Для контроля экспериментального исследования использовались животные 1 и 2 серии.

      Моделирование ЭОП проводили по методике MalletGuyP. (1971) во всех сериях эксперимента. Морским свинкам производили верхнесрединную лапаротомию и выделяли ПЖ. Далее в протоковую систему ПЖ вводили 0,5-1,0 мл стерильной гетерожелчи, полученной от пациентов, оперированных по поводу холедохолитиаза, с каплей аутокрови и, путем сдавления браншами анатомического пинцета тканей железы, вызывали ОП. Для дальнейшего введения лекарственных препаратов экспериментальным животным 2 и 3 серий в брюшную полость устанавливали эпидуральный катетер и брюшную стенку ушивали. Максимальный срок наблюдения животных составлял 5 суток.

      В экспериментальном исследовании мы применяли препарат «Октолипен» (МНН - тиоктовая кислота), ФАРМСТАНДАРТ-УфаВИТА, ОАО (Россия).

      Общее состояние морских свинок оценивали ежедневно по критериям двигательной активности, реакции на болевой и звуковой раздражители, пищевое поведение [12], а также оценки состояния шерсти животных. Для этого интегральную оценку тяжести состояния экспериментальных животных выражали средней арифметической количества полученных баллов.

      Выведение морских свинок из опыта проводили через 24, 72 и 120 часов от начала эксперимента путем ингаляции летальной дозы эфира с последующей декапитацией, для последующего морфологического изучения забирали ПЖ и печень, а для биохимического исследования – пробы крови, биоптаты ПЖ и печени.

      Морфологическое исследование полученного у экспериментальных животных материала (кусочки ПЖ и печени) проводили на световом и электронномикроскопическом уровнях. Определение  концентрации малонового диальдегида (МДА) проводили набором реактивов для определения ТБК-активных продуктов «ТБК–АГАТ», лактата – энзиматическим колориметрическим методом с использованием стандартного набора реагентов Ольвекс Диагностикум (Kat. No: 019.002).

      Статистическая обработка полученных результатов исследования проводились с помощью операционной системы Windows-8, программного комплекса Statistica v10.0 и Microsoft Office Excel 2010.

       Результаты и обсуждение. При проведении интегральной количественной оценки общего состояния экспериментальных животных с помощью соответствующей шкалы тяжести, нами была выявлена отрицательная динамика тяжести течения ЭОП с увеличением сроков наблюдения. Однако, в 3 серии, где в качестве лечения у морских свинок применяли ТК, общее состояние животных было менее тяжелым, чем в контрольных сериях, что выражалось в более высоких показателях оценки общего состояния морских свинок (таблица 1).

Таблица 1

Динамика общего состояния экспериментальных животных. 

Группы

Общее   состояние животных (в баллах, М±m)

1-е сутки

3-е сутки

5-е сутки

I. ЭОП без лечения (n=30)

1,1±0,2

0,8±0,2

0,5±0,1

II.ЭОП+0,9%раствор   хлорида натрия(n=30)

1,5±0,02

1,2±0,2

0,8±0,1

III. ЭОП + тиоктовая   кислота (n=30)

2,1±0,1*

1,6±0,1

1,4±0,1*

Примечание: * - р<0,05 - разница достоверна по сравнению со 2 серией эксперимента.

      Распределение летальности среди морских свинок за весь эксперимент указано на рисунке 1, из которого видно, что ТК снижает летальность морских свинок от ЭОП практически в 2 раза по сравнению с контрольной серией.

 

Рис. 1. Распределение летальности животных по сериям за весь эксперимент количественно и в процентах (за 100% принято 30 особей).

      Все погибшие (летальный исход) и выведенные из эксперимента животные для макроскопического изучения патологических изменений в брюшной полости подвергались аутопсии, в результате которой выявлено, что с увеличением сроков наблюдения наблюдается прогрессирование воспалительных и деструктивных процессов не только в ПЖ, но и в других органах брюшной полости. При применении ТК отмечались менее выраженные отек и геморрагическое пропитывание ПЖ, в брюшной полости незначительное количество серозного выпота, брюшина без налета фибрина, петли кишечника  незначительно раздуты, незначительное увеличение печени без признаков воспаления.

      Таким образом, при визуальной оценке положительный эффект применения ТК при ЭОП подтверждается не только менее тяжелым общим состоянием животных и снижением летальности, но и снижением выраженности макроскопических деструктивных процессов в ПЖ и других органах брюшной полости, выявленных при аутопсии.

      При изучении морфологических изменений в тканях ПЖ и печени в условиях индуцированного нами ЭОП (1 серия), было установлено, что данные изменения характеризуют картину не только ОП, но и острого гепатита. При этом степень изменений в ткани печени в значительной степени зависят от выраженности патологического процесса в ПЖ и подтверждают системность заболевания.

      Уже через 24 часа от начала эксперимента на фоне резко выраженного геморрагического отека наблюдаются локальные некротические изменения паренхимы и стромы ПЖ, диффузная полиморфноклеточная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов. В печени отмечается полнокровие, расширение межбалочных капилляров и просвета центральной вены.

      Значительные изменения при ЭОП протекают в системе микроциркуляторного русла. Наблюдается повышенная проницаемость стенок сосудов, в результате чего происходит экстравазация плазмы и форменных элементов крови и, как следствие, нарастает отек тканей ПЖ, более выраженный на 3 сутки от начала эксперимента. Уже на ранних стадиях ЭОП определялось резко выраженное полнокровие тканей печени и их отёк, расширение перисинусоидных пространств Диссе, слущивание клеток Купфера. В гепатоцитах наблюдались активные деструктивные процессы, которые сопровождались  нарушением межклеточных контактов. На этом же сроке в тканях ПЖ отмечается прогрессирование некротических и некробиотических процессов. При этом функциональная активность фибробластов и фибриллогенез в паранекротических  участках ПЖ  выражены крайне слабо.

      Структурно-функциональные изменения в паренхиме и строме ПЖ  нарастают к 5 суткам эксперимента и проявляются очаговыми процессами гистолиза, формированием лейкоцитарного вала вокруг погибших панкреатоцитов. В части гепатоцитов отмечалась жировая инфильтрация, жировые капли сливались и образовывали расположенные внеклеточно жировые кисты, вокруг которых возникала клеточная реакция с начальными признаками разрастания соединительной ткани.

      Изучение динамики МДА и лактата в сыворотке крови, тканях ПЖ  и печени 1 серии экспериментальных животных позволило установить, что при ЭОП происходит значительная активация анаэробного гликолиза, подтверждающая наличие ишемии в тканях, которая, в свою очередь, приводит к активации липопероксидации и дальнейшему прогрессированию патологических процессов в ПЖ и печени. Следует отметить, что при введении животным с ЭОП физиологического раствора хлорида натрия (2 серия эксперимента), каких-либо структурно-функциональных изменений паренхимы и стромы ПЖ, отличных от вышеперечисленных, не отмечалось.

      Картина морфологических изменений в ткани ПЖ и печени экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли ТК (3 серия), имела существенное отличие как на начальных этапах ЭОП, так и в развитии репаративных гистогенезов. При применении ТК при ЭОП отмечается менее выраженный отек тканей за счет снижения экстравазации плазмы и форменных элементов крови в периваскулярное пространство. В центрациназных клетках и клетках выводных протоков ПЖ были отмечены явления митоза. Начиная с 3-х суток эксперимента, имеет место более выраженная регенерация соединительной ткани в ПЖ, что свидетельствует о стимулируюшем влиянии ТК на пролиферативные процессы при ЭОП.Выявленные нами морфологические изменения свидетельствуют о том, что наряду с деструктивными и некротическими изменениями в тканях ПЖ, под ТК происходит восстановительный процесс экзокринного эпителия органа.

      При изучении влияния ТК на структуры печени в условиях ЭОП также отмечалась положительная динамика. Улучшение кровоснабжения печёночной дольки, уменьшение экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство приводило к стабилизации патологических изменений в клетках печени.

      При применении ТК в 3 серии животных так же, как и в первых двух сериях, отмечается активация липопероксидации в сыворотке крови, ткани ПЖ  и печени на всех сроках исследования, но она достоверно менее выражена, чем в предыдущих сериях. Введение морским свинкам ТК приводит также к снижению выраженности анаэробного гликолиза во всех изучаемых средах.

      Проведя корреляционный анализ МДА и молочной кислоты в сыворотке крови, тканях печени и ПЖ экспериментальных животных, мы отметили, что в 78% случаев в сравниваемых сериях имеет место прямая связь между изучаемыми процессами в сыворотке крови, тканях печени и ПЖ, что говорит о синхронности патобиохимических изменений в данных тканях. В 3 серии при анализе изменений между показателями сыворотки крови и ткани печени, а также ткани печени и ПЖ, отмечается обратная связь, что, вероятно, обусловлено значительным ростом уровня метаболитов в печени (таблица 2).

Таблица 2

Коэффициенты корреляции (r) между динамикой изучаемых биохимических показателей в исследуемых средах в сравниваемых сериях экспериментальных животных.

Показатели

серии

I

II

III

сыворотка   крови панкреатическая ткань

МДА

0,99

0,99

0,96

лактат

0,97

0,69

0,76

сыворотка   крови: ткань печени

МДА

0,8

0,34

-0,99

лактат

0,54

0,99

-0,93

ткань печени: панкреатическая   ткань

МДА

0,83

0,26

-0,99

лактат

0,72

0,69

-0,47

      Изучение динамики иммуноцитохимических показателей в 1 и 3 сериях выявило их разнонаправленность. Существенно более высокий уровень белка p53 через 24 и 72 часа в  1 серии свидетельствует о выраженной активации p53-зависимого апоптоза, одного из ключевых механизмов клеточного «самоубийства», что может играть важную роль в возникновении вторичного повреждения панкреатоцитов. Соответственно, уровень антиапоптотического белка bcl2 в 3 серии значительно выше, чем в 1 серии, что свидетельствует об уменьшении проапоптотической доминанты при применении ТК (рисунок 2).

Рис. 2. Динамика иммуноцитохимических показателей  центрацинозных панкреатоцитов (в %).

      Сопоставление динамики иммуноцитохимических и биохимических показателей в 1 серии выявило, что на фоне роста концентрации МДА и лактата во всех изучаемых средах имело место подавление синтеза белков p53 («страж генома») и bcl2 к 5 суткам эксперимента, что может свидетельствовать об угнетении механизмов, регулирующих программируемую клеточную гибель.

      Изучение динамики иммуноцитохимических и биохимических показателей в 3 серии выявило, что на фоне стабилизации и некоторого снижения МДА и лактата во всех изучаемых средах отмечается к 5 суткам стабилизация и небольшой рост уровня белка p53 и  значительное увеличение уровня bcl2 (таблица 3, 4).

Таблица 3

Коэффициенты корреляции (r) между биохимическими показателями и белком р53. 

Показатели

серии

I

II

р53: сыворотка крови

МДА

-0,98

-0,55

лактат

-0,93

-0,64

р53: ткань печени

МДА

-0,69

0,66

Лактат

-0,19

0,32

р53: панкреатическая ткань

МДА

-0,97

-0,76

лактат

-0,81

-0,98

 Таблица 4

Коэффициенты корреляции (r) между биохимическими показателями и белком bcl2. 

Показатели

серии

I

II

bcl2 : сыворотка   крови

МДА

-0,95

0,89

лактат

-0,87

0,83

bcl2 : ткань   печени

МДА

-0,59

-0,83

Лактат

-0,05

-0,97

bcl2 :   панкреатическая ткань

МДА

-0,94

0,73

лактат

-0,73

0,28

Заключение

      Полученные результаты свидетельствуют, что применение ТК позволяет снизить проявления ишемического поражения ткани ПЖ, а также сохранить значительную часть функционально активных структур ПЖ, что может быть использовано для разработки комплексных лечебных мероприятий, имеющих целью как сохранение жизни больных, так и повышение качества жизни последних, снижение уровня инвалидизации в дальнейшем за счет сохранения или восстановления функциональной активности ПЖ.

      Исходя из полученных результатов данного исследования, считаем целесообразным включение ТК в комплекс лечебных мероприятий в рамках концепции «обрывающей» терапии при ОП.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Волков, А.Н. Оптимизация комплексного консервативного лечения больных острым деструктивным панкреатитом в реактивной фазе, озонотерапией и иммунокоррекцией / A.Н. Волков, В.В. Ворончихин, А.Г. Дербенев // Анналы хирургической гепатологии. - 2008. - T. 13, № 3. - C. 220.
  2. Герасимчук, Л.А. Интенсивная терапия больных с острым деструктивным панкреатитом в условиях многопрофильной больницы / Л.А. Герасимчук, В.В. Спас, И.А. Шапель // Медицинские новости. - 2005. - № 7. - С. 64-66.
  3. Демин, Д.Б. Патогенетическое обоснование комплексного лечения острого панкреатита: автореф. дис... докт. мед. наук / Д.Б. Демин. - Оренбург,  2010. - 50 с..
  4. Затевахин, И.И. Панкреонекроз: диагностика, прогнозирование и лечение / И.И. Затевахин, М.Ш. Цициашвили, М.Д. Будурова и др. - Москва, 2007. - 223 с.
  5. Иванов, В.Г. Антиоксиданты / В.Г. Иванов, В.А. Горленко. -  М.:  Академия,  2009.  -  320  с.
  6. Корымасов, Е.А. Новый вариант «обрывающей терапии» панкреонекроза / Е.А. Корымасов, Ю.В. Горбунов, М.Н. Жарков, В.В. Хайдаров, P.M. Джарар, A.M. Кричмар // XIX Международный Конгресс хирургов-гепатологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы хирургической гепатологии»: Сборник материалов. - Иркутск, 2012. - С. 148-149.
  7. Мальгина, Н.В. Применение мексидола в комплексном лечении острого панкреатита / Н.В. Мальгина // Хирургия. - 2006. - №10. – С. 42-50.
  8. Пельц, В.А. Современное состояние диагностики и хирургического лечения острого панкреатита / В.А. Пельц // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - №4-1. - С. 27-32.
  9. Савельев, B.C. Панкреонкрозы / В.С. Савельев, М.И. Филимонов, С.З. Бурневич. - М.: МИА, 2008. – 264 с.
  10. Тимербулатов, М.В. Комплексный подход к лечению острого панкреатита / М.В. Тимербулатов, Е.И. Сендерович, Р.Р. Рахимов и др. // Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. - Т. 8, № 6. - С. 100-102.
  11. Толстой, А.Д. Шок при остром панкреатите / А.Д. Толстой, В.П. Панов, Е.В. Захарова. - Санкт-Петербург : Скиф, 2004. - 64 c.
  12. Фадеев, С.Б. Интегральная количественная оценка общего состояния животных в экспериментальной хирургии / С.Б. Фадеев, Д.В. Волков // Вестник ОГУ, 2013. - № 1. - С. 147-150.
  13. Beger, H.G. Severe acute pancreatitis: clinical course and management / H.G. Beger, B.M. Rau // World J. Gastroenterol. - 2007. - Vol. 13., № 38. - P. 1043-1051.
  14. Connor, S. Surgery in the treatment of acutepancreatitis — minimal access pancreatic necrosectomy /  S. Connor, M.G. Raraty, N. I lowes // Scand J. Surg. - 2005. - Vol. 94, № 2. – Р. 135-142.

 

New aspects of antioxidant therapy of acute pancreatitis (experimental data).

The article shows the efficacy of thioctic acid in a dose of 10 mg/kg in experimental acute pancreatitis in Guinea pigs. The authors founded that the use of thioctic acid are significantly reduced manifestations of ischemia and the severity of free-radical processes, and its stimulate reparative processes in the tissues of the liver and pancreas, indicating the effectiveness of this drug in the treatment of experimental acute pancreatitis.

Key words: acute pancreatitis, thioctic acid, lipid peroxidation, ischemia.

 

Сведения об авторах

  • Анисимова Алёна Алексеевна - заочный аспирант кафедры факультетской хирургии ФГБОУ ВО «ОрГМУ» Минздрава России, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.
  • Демин Дмитрий Борисович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой факультетской хирургии ФГБОУ ВО «ОрГМУ» Минздрава России, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

Метки и направления этого материала: